BSA混合分离分析法
BSA（Bulked Segregant Analysis）又称混合群体分离分析法，是利用极端性状进行功能基因挖掘的一种方法。主要思想是将两个具有极端性状的群体进行混池测序，比较两个群体在多态位点（SNP）的Allele Frequency（AF）是否具有显著差异。以植物株高性状为例，收集株高处于两个极端的样本分别混池测序，通过全基因组扫描，找到AF具有显著差异的位点，然后通过相关研究结果，对这些位点进行筛选，找到影响株高的功能位点。?
BSA在1991年就被提出(Giovannoni et al., 1991; Michelmore et al., 1991)，只不过当时使用的标记不是SNP而是RAPD和RFLPs等传统标记。随着二代测序的发展，SNP标记的开发和测序成本的下降，使BSA技术成为QTL定位的有力工具。?
最近在BSA技术上的出色工作，主要为日本Iwate Biotechnology Research Center的一个团队。他们开发出了MutMap（Abe, A. et al., 2012）、QTL-seq（Takagi, H. et al., 2013）、MutMap+（R Fekih et al., 2013）、MutMap-Gap（Takagi, H. et al., 2013）等。???
先来说说MutMap。MutMap的基本原理如图1，野生型（Wild-type）经过EMS诱变得到突变型（Mutant），筛选感兴趣的突变株经过多代自交后性状稳定后与野生型杂交得到F1，F1自交得到F2，将F2代中与野生型性状不同的个体混池测序（20-50株），同时将野生型测序作为参考序列。计算每个SNP的index（与参考序列不同的reads数占总reads数的比例），将SNP-index显著高于期望（可以通过bootstrap的方法检验显著性水平）的SNP位点作为引起该突变的候选位点。
上面说得是标准流程，也可以直接用突变型自交得到子代池。这样整个流程就没有杂交的过程，适用于某些杂交困难的物种。?除了使用F2代，也可以用RILs群体，虽然周期长，操作复杂，但是适合定位微效QTL。
今天再说一说MutMap+和MutMap-Gap，两者都是基于MutMap。前者适用于不能用突变型和野生型杂交的情况，比如纯合突变是致死，不育或者严格自交且人工杂交困难的物种。后者适用于参考基因组和亲本基因组差异较大，比如存在SV（结构变异），而引起表型差异的突变刚好存在于亲本specific的区域（即亲本与参考基因组比较，存在SV的区域）。
MutMap+
MutMap+的原理如图1，将野生型（WT）诱变得到的突变型（M1）自交得到M2，因为诱变产生的突变型一般是杂合的，在M1中不会表现出突变表型（尽管显性突变或者加性突变会在M1中表现，这里不作讨论，我们这里只关注隐性突变）。将M2种植后观察表型，统计野生型和突变型是否符合3:1的分离比（卡方检验），如果符合，我们认为该突变表型为隐性遗传。将M2野生型自交得到M3，选择M3野生型和突变型分离比为3:1的子代池，将两种表型各选20-40株混池测序（测序深度10 x以上），将测序结果比对到参考基因组，计算SNP-index（和野生型不同的reads占总reads的比例）。与MutMap不一样的是，在MutMap+中的两个混池中出现很多不是导致突变性状的SNP位点的index等于1（图1D），这是因为在M2中随机固定下来的突变的SNP（理解为遗传学中的奠基者效应吧），这些位点在两个池中同时存在，所以我们将突变池的SNP-index减去野生池的SNP-index后，得到的ΔSNP-index中，就消除了这种“干扰”，此时，我们将ΔSNP-index显著大于0（bootstrap或者说置换检验判断显著性）的位点作为候选位点（图1E）。
文章中，作者也将野生亲本测序了，因为作者对这个亲本做了一些列的研究，在我们实际项目中，不测亲本是完全可行的：我们根据参考基因组计算SNP-index（与参考基因组不同的reads占总reads的比例），对应的，在ΔSNP-index中显著大于或者小于0的位点，都应该作为候选位点。
直接用突变型连续自交的子代池计算SNP-index，这样做也是可行的。但是经过诱变后，连续自交后随机固定下来的位点较多，与亲本相比，会出现较多的假阳性。而MutMap+的两个池都是来自于M2，遗传背景一致，所以假阳性大大减少。
图1 MutMap+原理图（R Fekih et al., 2013）
MutMap-Gap
MutMap-Gap和MutMap基本一致，只是多了一个de novo组装的过程。如图2，作者按照MutMap的流程，最后发现候选区域不存在导致基因功能改变的SNP，结合之前的研究，认为这段区域可能有SV，且导致突变表型的SNP位点存在于SV中。于是，如图3，作者收集了亲本unmapped的reads以及这段候选区域mapping上的reads，加上测一些mate-pair reads，作了de novo组装，然后将组装的序列和之前的参考序列一起作为参考序列再做一遍mapping以及从新计算SNP-index，作者发现，只有2个存在于组装序列的SNP-index显著，且通过基因预测，发现有一个SNP刚好导致了基因功能的改变（剪接位点）。
图2 MutMap-Gap原理图a（Takagi, H. et al., 2013）
图3 MutMap-Gap原理图b（Takagi, H. et al., 2013）
BSA系列最后一个方法：QTL-seq（当然，BSA的方法远不止这些，但原理是相同的，不同的是实验设计）。
QTL-seq与之前的MutMap系列最大的不同在于研究的材料不同：MutMap是用诱变得到的材料，而QTL-seq可用于自然存在的材料。
QTL-seq的原理如图，我们将两个具有极端性状（如株高的高矮）的亲本杂交，得到F1，F1自交后得到性状分离的子代池F2，经过检验发现F2的性状成正态分布，说明这是一个数量性状。我们将F2中的极高和极矮个体分别混池测序，计算每个SNP位点的SNP-index（该位点与参考序列不同的reads数占总reads数的比例），然后将两个SNP-index相减得到ΔSNP-index，我们将ΔSNP-index显著偏离0的位点作为候选位点。
图 QTL-seq原理（(Takagi, Abe et al. 2013)
这里可能会有人问，为什么不直接用两个极端性状群体的混池测序找差异位点，却需要杂交一次？这是因为这两个个体或群体可能亲缘关系较远，除了导致性状差异的位点，还存在大量和所研究性状无关的位点也存在差异，这样就给我们定位带来了麻烦。文章的后面就提到了，QTL-seq可以研究两个近期受自然或人工选择的群体，比如一个适应干旱环境，一个却不耐旱，比如一个高产，一个低产。文章建议分别混池测序具有极端性状的两个群体，而不经过杂交，这样做肯定没有经过杂交的可靠，因为这两个群体可能经过了长时间的隔离，群体中可能存在大量随机固定下来的差异位点，这会干扰我们的结果。不过，我们不仅仅看ΔSNP-index，重要是将ΔSNP-index按照滑动窗口拟合了曲线，这是结合了LD的思想：受选择的位点会因为LD的原因，将其附近的标记也一起遗传，如果这些适应性的性状是来自于少数几个祖先，那么结合LD就会为我们排除大量的随机固定的差异位点。同时，我们还可以结合染色体区段的多态性（如π和Hp），对结果进行验证：select-sweep作用会降低受选择位点附近的多态性。这样，就给不适合杂交的情况（比如某些动物很难人工杂交或者后代较少），提供了一个研究的思路。
文章来源：http://blog.sina.com.cn/s/blog_14cce7aed0102vq2p.html